Verslagen en mededelingen van de Koninklijke Vlaamse Academie voor Taal- en Letterkunde 1909

[p. 327]

Beknopte monographie van Bacillus Prodigiosus
(eene bacterie met roodgekleurde coloniën)
met nieuwe proefnemingen
door D^r A.J.J. Vandevelde en L. Bosmans.

De proefondervindelijke studie van de prachtige bacterie, welke den naam Bacillus prodigiosus draagt, is voor beginnelingen in de bacteriologie zeer aantrekkelijk. Door hare buitengewone ontwikkeling, door de vorming van hare wonderschoone bloedroode coloniën, door de gemakkelijke bereiding der verscheidene cultuurbodems waarop zij ingezaaid wordt en groeien kan, door haren onbeduidenden giftigheidsgraad, mag deze bacterie voor het onderzoek zeer wel geschikt heeten.

Daarom hebben wij in deze verhandeling, niet alleen de uitslagen van nieuwe proefnemingen medegedeeld, maar ook in korte woorden samengevat wat ons door de studie van de zoo uitgebreide bibliographie van het onderwerp bekend is. Aldus stellen wij een leidraad ter hand aan diegenen, die zich wenschen te oefenen in de kennis der bacteriën, welke onze levensmiddelen aantasten.

In den loop van deze verhandeling zullen de bibliographische aanteekeningen telkens op de daartoe best geschikte plaatsen worden aangegeven. Alleen zij hier gezegd, dat de twee standaardwerken van F. Lafar⁽¹⁾ en E. Macé⁽²⁾, over het thans bestudeerd onderwerp zeer veel gegevens inhouden.

(1) F. Lafar, Handbuch der technischen Mykologie, Bd. I, 1904-1907, blz. 34, 36, 80, 85, 222, 224, 225, 288, 289, 325, 328, 348, 365, 367, 368, 395, 396, 411, 413, 415, 450, 455, 456, 461, 481, 490, 586, 648, 684 en 690.

(2) E. Macé. Traité pratique de bactériologie, 1904, 5^e uitgave, 1021-1024.

[p. 328]

I. - Vindplaats.

Bacillus prodigiosus is in de lucht, in het water, in den grond, zeer verspreid: daaruit kan zij zich op allerlei organische stoffen ontwikkelen, zooals zetmeelhoudende stoffen (vochtig meel, vochtig brood, aardappelen), eiwitstoffen, vleesch⁽³⁾.

De coloniën groeien op vaste bodems, onder den vorm van kleine roode vlekjes, welke in het begin bleekrood zijn, en later bloedrood worden. In rauw voedsel, zooals melk⁽⁴⁾, kaas, enz., is Bacillus prodigiosus geen zeldzaamheid; ontwikkelt zich deze in vloeistoffen, dan worden zij daardoor roodgekleurd.

Hoe de besmetting door Bacillus prodigiosus zich op brood voordoet, is sedert langen tijd gekend. Vroeger gebeurde het niet zelden dat bakkerijen op de hevigste wijze door deze bacterie werden aangetast. Het geval deed zich namelijk, in 1843, te Parijs voor, alswanneer groote voorraden brood der militaire bakkerijen met roode vlekjes werden bedekt, welke niets anders waren dan coloniën van Bacillus prodigiosus.

Aan een soortgelijke besmetting wordt het verschijnsel van het met bloed bedekte misbrood (Hostienpilz) toegeschreven. Graankorrels⁽⁵⁾ kunnen ook besmet worden; het zaadwit wordt in zijne bestanddeelen ontbonden: eerst is dit het geval met dezetmeelkorrels. dan met de stikstofhoudende stoffen, en eindelijk met de celstof.

In vroeger tijden is het menigvuldig verschijnen van Bacillus prodigiosus de oorzaak geweest van vele waarnemingen⁽⁶⁾, welke, door de onwetendheid waarin onze voorvaders in zake bacteriologie verkeerden, soms tot zeer zonderlinge feiten aan-

(3) P. Kuebler. Ueber das Verhalten des Micrococcus prodigiosus in saurer Fleischbrühe. Centr. Bakt., 1889, 5, 333. - G. Bordoni. Fall von fuchsinähnlicher Bakterienfärbung des Fleisches. Hyg. Rundschau, 1894, 4, 12.

(4) A. Lux. Ueber den Gehalt der frisch gemolkenen Milch an Bakterien. Centr. Bakt., 2^e Abt., 1903, 11, 195.

(5) Prillieux. Corrosion de grains de blé colorés en rose par des bactéries. Bull. Soc. bot. France, 1874, 31.

(6) Mary Hefferan. A comparative and experimental study of bacilli producing red pigment. Centr, Bakt., 2^e Abt., 1904, 11, 311-317, 397-404, 456-475, 520-540.

[p. 329]

leiding hebben gegeven. Reeds in de 2^e eeuw na Christus deelt Lucianus^(6a) in een van zijne samenspraken mede, dat Pythagoras aan zijne leerlingen had verboden boonen te eten, omdat gekookte witte boonen in het maanlicht gebracht in bloed kunnen worden omgezet. Sedert Pythagoras waren de boonen, voor deze rede, niet als een normaal voedsel aangezien.

In het jaar 332 vóór Christus, bewees het zoogezegde bloedwonder aan Alexander den Groote, bij het veroveren der stad Tyr, een gewichtigen dienst: op zekeren dag werd het brood, bij het breken daarvan, door de krijgslieden, van binnen rood gevlekt bevonden. Welnu, aan de reeds verschrikte belegeraars verklaarden alsdan de priesters, dat het aantreffen van bloed binnen in het brood een bloedig noodlot, in de stad, en niet buiten de stad, voorspelde.

In de Middeleeuwen waren, naar aanleiding van de over het bloedrood misbrood in omloop gebrachte gedachten, de veroordeelingen van onschuldigen zoo talrijk, dat, volgens Scheurlen⁽⁷⁾, de onrechtstreeksche misdaden van Bacillus prodigiosus als grooter dienen beschouwd te worden dan de rechtstreeksche treurige gevolgen van menige ziektebacteriën.

Eerst in 1819, werd door Bizro⁽⁸⁾ de zwamachtige natuur van Bacillus prodigiosus vastgesteld. Onder de benaming van Serratia marescens⁽⁹⁾, geeft deze geleerde daarvan de volgende beschrijving: Funguli acaules, semisphaerici, capsulis contorsis. Serratia marescens. Vesicula tenuissima, latice primo roseo dehinc rubro, repleta⁽¹⁰⁾.

(6a) Lucianus, § 6 van ‘Βιων πρασις’ (De sekten op de veiling):
De koopman: ‘Verfoeit u de boonen?’
Pythagoras: ‘Neen, maar zij zijn gewijd, en hare natuur is wonderbaar. Ten eerste.... Kookt u ze en stelt u ze bloot aan de maanstralen gedurende een bepaald getal nachten, zoo maakt u bloed daarvan’.
De koopman: ‘U spreekt wel, evenals het orakel’.

(7) E. Scheurlen. Geschichtliche und experimentelle Studien über den Prodigiosus. Arch. Hyg., 1896, 21, 1.

(8) B. Bizio. Gazzetta privilegiata di Venezia. 24 Aug. 1819.

(9) Deze naam van Serratia werd gegeven ter eere van Serratus, den geleerde die de eerste op den stroom Arna een stoomboot liet varen.

(10) Vertaling van deze latijnsche beschrijving: ‘Kleine zwammen zonder takjes, half-bolvormig, met gewrongene hokjes. Serratia marescens. Cellen zeer klein, gevuld met eerst roosachtig, daarna rood sap’.

[p. 330]

Sette⁽¹¹⁾ bestudeerde, evenals Bizio, de gevallen der roode vlekken van het brood te Legnaro, bij Padua, en gaf aan de zwam den naam van Zoogalactina immetropa.

In 1844, kwam Bizio⁽¹²⁾ met de Academie van Wetenschappen van Parijs in betrekking, ter gelegenheid van het vaststellen van eene besmetting van het brood voor het Fransche leger bestemd.

Na eene studie over dergelijke gevallen welke zich te Berlijn hadden voorgedaan, werd door Ehrenberg⁽¹³⁾ de naam van Prodigiosus in de wetenschap gebracht.

Latere onderzoekingen hebben bewezen dat buiten Bacillus prodigiosus, nog andere bacteriënsoorten het vermogen bezitten een roode kleur voort te brengen, waaronder namelijk Bacillus ruber indicus, Bacillus ruber plymouthensis, Bacillus mesentericus ruber, Bacillus lactis erythrogenes, enz.

(11) Sette. Memoria storico naturale sull' arrossamento straordinario di alcune sostanze alimentose. Venice, 1824.

(12) B. Bizio. Sur une altération du pain causée par le développement d'un cryptogame; observation faite il y a très longtemps d'un phénomène qui rentre dans la classe de ceux sur lesquels Möser a appele l'attention. Compt. rend. Paris, 1844, 18, 951-953.

(13) C.G. Ehrenberg. Monatsber. über die zur Bekanntmachung geeigneten Verhandl. d. kgi. preuss. Akad. Wiss. Berlin, 1839.

II. - Morphologie.

Bacillus prodigiosus⁽¹⁴⁾ (Ehrenberg), - ook Micrococcus prodigiosus⁽¹⁵⁾ (Cohn), of Bacterium prodigiosum⁽¹⁶⁾ (Schroeter), genoemd, - heeft gewoonlijk de gedaante van korte staafjes, zelden van kogeltjes⁽¹⁷⁾. Kweekt men de bacterie in

(14) O. Erdmann. Bildung von Anilinfarben aus Proteinkörpern. Journ. prakt. Chemie, 1866, 3, 385.

(15) F. Cohn. Untersuchungen über Bakterien. Beitr. Biol. Pflanzen, 1872, I, 127.

(16) J. Schroeter. Ueber einige durch Bakterien gebildete Pigmente. Cohns Beitr. Biol. Pflanzen, 1872, I, 109.

(17) Als gevolg van den kogelachtigen vorm, werd aan deze soort de naam van Micrococcus gegeven. M. Schottelius. Untersuchungen über den Micrococcus prodigiosus. Festschr. Koerliker, Leipzig, Centr. Bakt., 1887, 2, 439.

[p. 331]

zwakzuur bouillon⁽¹⁸⁾, dan wordt de langwerpige vorm bijzonder duidelijk.

Migula⁽¹⁹⁾ vond dat de breedte gewoonlijk 0.5 μ (0,0005 mm.) bedraagt, en de lengte 0.5 μ tot 1 μ (0.0005 mm. tot 0.001 mm.); soms zijn de bacteriën tot snoeren van 2 tot 6 cellen vereenigd. De cellen zijn slechts weinig met haartjes voorzien.

In vloeibare bodems kan deze bacterie zich bewegen, in vaste bodems niet. Dit vermogen zou verzekerd worden door het bestaan⁽²⁰⁾ van 4 tot 8 haartjes, welke de kleurmethode van Loeffler⁽²¹⁾ zichtbaar heeft gemaakt.

Wat die bewegingen betreft, zegt Matzuschita⁽²²⁾, dat zij bij 20°C sterk zijn en bij 37°C bijna afwezig, terwijl Lafar⁽²³⁾ juist het omgekeerde beweert.

Sporen zijn nooit gevonden geweest.

Het kleuren der cellen door de gewone methoden, leidt gewoonlijk tot onbeduidende uitslagen; door de methode van Gram⁽²⁴⁾, bekomt men geen kleuring.

Goupil⁽²⁵⁾ heeft de morphologische eigenschappen van Bacillus prodigiosus in duidelijke tabellen samengevat.

(18) E. Wasserzug. Variations durables de la forme et de la fonction chez les bactéries. Ann. Inst. Pasteur, 1888, 2, 153.

(19) W. Migula. System der Bakterien, Jena, 1900, II.

(20) E. Scheurlen. Geschichtliche und experimentelle Studien über den Prodigiosus. Arch. Hyg., 1896, 26, 1.

(21) De methode van Loeffler bestaat hierin, dat de bacteriëncellen met methyleenblauw (een anilinekleur) in zwakalkalisch alcoholische oplossing blauw gekleurd worden, waardoor zekere weinig duidelijke celdeelen zichtbaar worden.

(22) T. Matzuschita. Der Einfluss der Temperatur und Ernährung auf die Eigenbewegung der Bakterien. Centr. Bakt., 2^e Abt., 1901, 7, 209.

(23) Lafar. Handbuch, I, 1904, 85. Zie (1).

(24) De methode van Gram bestaat hierin, dat de bacteriën met eene anilinekleurstof, gentianapaars of kristalpaars, bij aanwezigheid van jood en eosine, worden gekleurd; op deze wijze worden de cellen, en in 't bijzonder zekere celdeelen, in de microscopische praeparaten op een roosgekleurd veld zeer duidelijk paars. Volgens de soorten, worden de bacteriën al of niet, door de genoemde proefvochten gekleurd.

(25) P. Goupil. Tableaux synoptiques pour l'examen bactériologique de l'eau. Paris, 1902, 42-43.

[p. 332]

III. - Werking van de levensvoor-waarden.

A. - Temperatuur en lucht.

Het temperatuursoptimum ligt rond 25°C; op 35°C, en daarboven, wordt het voortbrengen van kleurstof trager, om weldra op te houden. Wordt een hooge temperatuur langen tijd behouden, dan verdwijnt ook het vermogen tot kleurvorming.

Dieudonné⁽²⁶⁾ vond dat een voortdurende cultuur op 37°C tot ontkleurde coloniën had aanleiding gegeven; deze laatste nu op 22°C gekweekt, gaven, slechts na 35 generatiën, gekleurde culturen terug.

Volgens Schenk⁽²⁷⁾, zou Bacillus prodigiosus positieve thermotaxis vertoonen, wat beteekent dat de cellen zich naar een verwarmde plaats van het praeparaat wenden. In hangende cultuurdruppels richten zich de cellen zeer regelmatig naar een koperen draad, waarmede door indompeling een bepaalde plaats van de vloeistof wordt verwarmd.

Tegen warmte is Bacillus prodigiosus zeer weinig bestand: op 60-80°C worden de cellen vernietigd, terwijl een langdurige uitdroging daarentegen den dood niet veroorzaakt.

Bacillus prodigiosus ontwikkelt zich niet zonder lucht, en is wat men noemt een streng aerobisch wezen. Ook zonder zuurstof ontstaat er geen kleur; worden de coloniën, in het begin van de ontwikkeling, wanneer zij nog witachtig zijn, onder olie gebracht, - waardoor de toevoer van lucht tegengehouden wordt, - dan blijven de coloniën kleurloos.

Het zuurstofmaximum voor de ontwikkeling is 5.45 tot 6.32 atmosferen druk⁽²⁸⁾.

(26) In: A. Fischer, Vorlesungen über Bakterien. Jena, 1903.

(27) S.L. Schenk. Die Thermotaxis der Mikroorganismen und ihre Beziehung zur Erkältung. Centr. Bakt. 1893, 14, 37.

(28) T. Porodko. Studien ueber den Einfluss der Sauerstoffspannung auf pflanzliche Mikroorganismen. Jahrb. Wiss. Bot., 1904, 41, 1-64.

[p. 333]

B. - De roode kleurstof.

De roode kleurstof bevindt zich alleen⁽²⁹⁾ in het binnenste der cellen en is het gansche protoplasma door verspreid. Enkel bij aanwezigheid van zuurstof ontstaat de kleur; in diepe gelatinelagen of onder eene olielaag blijven de culturen ongekleurd.

De kleurstof, waaraan de naam van prodigiosine wordt gegeven, heeft het veimogen wol en zijde te kleuren⁽³⁰⁾; zij is in water niet oplosbaar, maar wel een weinig in alcohol, aether, chloroform, benzol en zwavelkoolstof.

Deze alcoholische oplossing is geelachtig rood, wordt door de zuren karmijnrood, daarna paars⁽³¹⁾; door alkali ontstaat een gele kleur. De gekleurde oplossingen worden met zink en zoutzuur volkomen kleurloos; door toevoeging van een zuur ontstaat opnieuw de roode kleur. Terwijl de kleur der oplossingen jaren lang in het donker onveranderd blijft, wordt zij daarentegen door het licht aangetast. Tevergeefs heeft men beproefd de kleurstof onder den vorm van kristallen⁽³²⁾ af te zonderen.

Volgens Rosenberg⁽³³⁾ kan men twee verschillende kleurstoffen onderscheiden, de eene geel, de andere rood; de gele kleurstof zou, door verwarming met water, in de roode worden omgezet.

De kleurstof prodigiosine is door verscheidene onderzoekers⁽³⁴⁾ bestudeerd geworden. De scheikundige formule komt

(29) M. Schottelius. Biologische Untersuchungen über den Micrococcus prodigiosus. Centr. Bakt., 1887, 2, 439.

(30) O. Rosenberg. Zeitschr. wiss. Mikrosk., 1898, 15, 56. - E. Strasburger. Bot. Praktikum, Jena, 1902.

(31) G. Uffreduzzi. Giorn. Soc. Ital. Igiene, 1894; Hyg. Rundschau, 1894, 1.

(32) E. Kraft. Beiträge zur Biologie der Bacterium prodigiosum und zum chemischen Verhalten seines Pigmentes. Würzburg, 1902.

(33) W.W. Rosenberg. Beuräge zur Kenntnis der Bacterienfarbstoffe, insbesondere der Gruppe des Bacillus prodigiosus. Würzburg, 1899.

(34) J. Schroeter. Beitr. Biol. Pflanzen, 1875, I, 109.
P. Schneider. Die Bedeutung der Bakterienfarbstoffen für die Unterscheidung der Arten. Drs. Basel, 1894.
O. Helm. Ueber Monas proaigiosa und von ihr erzeugten Farbstoff. Arch. Pharm, 1875, 3, 19.
P. Spica. Sulla materia colorante prodotta dal Micrococcus prodigiosus. Atti Ist. Veneto Scienze, 1900, II, 1025.

[p. 334]

overeen met C₃₈H₅₆NO₃ met 2.3% stikstof volgens Griffiths,⁽³⁵⁾ 3.9% stikstof volgens Kraft⁽³⁶⁾; de asch houdt chloor, phosphoor, natrium en ijzer in, met 38.01% berekend phosphoorzuur anhydrid P₂O₅.

Door achtereenvolgende culturen vermindert het vermogen tot vorming van kleurstof, zoodanig dat na een zeker aantal generaties de culturen roosachtig of bruinachtig, daarna heel en al wit worden. Zelfs onder ongunstige vooiwaarden verliest de bacterie hare eigenschappen om kleurstof voort te brengen; aldus ontstaan echte achromogene rassen.

Trouwens bij de gekleurde culturen vindt men ook een vrij aanzienlijke veranderlijkheid. Hefferan⁽³⁷⁾ heeft in dien zin zeven rassen kunnen bestudeeren. Door een sterke voeding kan men witte varieterten⁽³⁸⁾ bekomen, doch zonder merkelijke uitwendige oorzaken, komen deze varieteiten weldra tot de gekleurde terug.

Volgens Kuntze⁽³⁹⁾ zijn kleine hoeveelheden zwavel en magnesium in den bodem noodig, tot het vormen van magnesiumsulfaat, dat tot het ontstaan van de roode kleurstof onontbeerlijk schijnt te zijn. De door Kuntze benuttigde cultuurbodem heeft de volgende samenstelling:

1	gr. ammoniumsuccinaat
2	gr. glycerine
0.1	gr. kaliumphosphaat (KH2PO4)
0.2	gr. magnesiumsulfaat
100	gr. water.

(35) A.B. Griffiths. Sur la matière colorante du Monas prodigiosa. Compt. rend. Paris, 1892, 115, 321.

(36) E. Kraft. Beiträge zur Biologie der Bacterium prodigiosum und zum chemischen Verhalten seines Pigmentes. Diss. Würzburg, 1902.

(37) Mary Hefferan. Op. cit., 1904. Zie (6).

(38) E. Luckhardt. Ueber Variabilität und Bedingungen der Farbstoffbildung bei Spaltpilzen. Diss. Freiburg, 1901.

(39) W. Kuntze. Ein Beitrag zur Kenntnis der Bedingungen der Farbstoffbildung des Bacillus prodigiosus. Zeit. Hyg., 1900, 34, 169.
W. Kuntze. Weitere Bemerkungen zur Farbstoffbildung des Bacillus prodigiosus. Centr. Bakt., 1^e Abt., 1907, 44, 299-309.

[p. 335]

Fraenkel⁽⁴⁰⁾ maakt liever gebruik van de voedende oplossing van Uschinsky, welke hij op de volgende wijze heeft vereenvoudigd:

Chloornatrium: 5 gr.

Kaliumphosphaat (KH2PO4): 2 gr.

Melkzuurammonium: 6 gr.

Asparagine: 4 gr.

Water: 1000 gr.

Natriumhydroxyd, tot neutrale reactie.

Samkow⁽⁴¹⁾ deed over de kleurstof van Bacillus prodigiosus een zeer grondig onderzoek, waaruit is gebleken dat de aanwezigheid van magnesium, alsook een overvloedige toevoer van luchtzuurstof, onontbeerlijk zijn, zelfs in de beste voedingsvoorwaarden. Samkow kweekte deze bacterie in een voedende oplossing samengesteld als volgt:

Asparagine: 10 gr.

Glucose: 5 gr.

Kaliumphosphaat (KH2PO4): 2 gr.

Natriumcarbonaat Na2CO3: 2.5 gr.

Magnesiumsulfaat: 0.4 gr..

Gedistilleerd water: 1 liter.

Asparagine werd achtereenvolgens vervangen door andere stikstofverbindingen, peptone, ammoniumzouten, hippuurzuur, zoutzuuramline, uraea, chinoline, pyridine; deze vervangingen hadden als gevolg de vorming van de roode kleurstof niet te beletten.

Buiten glucose werden als koolstofverbindingen de volgende stoffen benuttigd, welke alle met peptone tot positieve uitslagen leidden: melksuiker, zetmeel, dextrine, manniet, glycerine, alcohol, melkzuurcalcium, wijnsteenzuurkalium, zuur kaliumcitraat, maloonzuur, appelzuur, zuringzuur, kinazuur, barnsteenzuur, glycolzuur, pyrowijnsteenzuur, fumaarzuur, maleinezuur, amygdaline en salicine.

Met ammoniumnitraat, chloorammonium, ammoniumphosphaat en ammoniumsulfaat geeft zuringzuur negatieve, en kinazuur positieve uitslagen.

(40) C. Fraenkel. Grundriss der Bakterienkunde. Berlin, 1894.

(41) S. Samkow. Zur Physiologie des Bacillus prodigiosus. Centr. Bakt., 1903, 11, 305-311.

[p. 336]

Met glucose ontstaat geen kleurstof bij aanwezigheid van een der volgende verbindingen: zoutzuuraniline, hippuurzuur, chinoline, pyridine; terwijl met uraea, peptone, asparagine en ammoniumzouten positieve uitslagen weiden bekomen.

Niet zonder belang is het hier vast te stellen dat, in de afwezigheid van glucose, evenals van natriumcarbonaat in de hoogere aangegeven oplessing, de ontwikkeling even zoo goed geschiedt als in de aanwezigheid dezer verbindingen. In de afwezigheid van magnesiumsulfaat daarentegen, groeit Bacillus prodigiosus wel, doch zonder kleurstof te vormen.

Zonder phosphaten kan ook geen kleurstof ontstaan, zooals gebleken is uit de volgende proeven met glucose en magnesiumsulfaat inhoudende cultuurvochten:

Geen kleur, bij aanwezigheid van ammoniumnitraat en kaliumphosphaat, - ammoniumnitraat en chloorkalium, - ammoniumsulfaat en kaliumphosphaat, - ammoniumsulfaat en chloorkalium, - ammoniumsulfaat en kaliumnitraat, - chloorammonium en kaliumnitraat, - asparagine en chloorkalium, - asparagine en kaliumnitraat.

Kleur, bij aanwezigheid van ammoniumnitraat, kaliumphosphaat en chloorkalium, - ammoniumsulfaat, kaliumphosphaat en chloorkalium, - ammoniumphosphaat en chloorkalium, - chloorammonium en kaliumphosphaat, - asparagine en kaliumphosphaat.

Dezelfde uitslagen werden bekomen met kinazuur en magnesium, met de volgende uitzonderingen: kleurstof bij aanwezigheid van ammoniumnitraat en kaliumphosphaat, - ammoniumphosphaat en kaliumnitraat.

Deze omvangrijke proefneming werd ook in dezefde voorwaarden genomen, doch zonder magnesiumsulfaat: in geen enkel geval werd alsdan de roode kleurstof teruggevonden.

Daar magnesiumsulfaat in de proeven was gebruikt geweest, was het noodig vast te stellen welk van de bestanddeelen dezer verbindingen de belangrijkste rol had gespeeld, ofwel het magnesium, ofwel het gebonden zwavel in het sulfaat.

Om deze vraag op te lossen, werden culturen gedaan in vloeistoffen met asparagine, glucose, kaliumphosphaat, natriumcarbonaat, en dan in het eene geval met chloormagnesium, in het andere met de twee zwavelverbindingen kalium- en natriumsulfaat. Alleen in de magnesiumhoudende vloeistoffen onstond een

[p. 337]

roode kleur, terwijl de bodems met sulfaten kleurloos bleven. Aldus was de noodzakelijkheid van het gebruik van magnesium wel duidelijk bewezen.

Zeer zonderling mag het heeten, dat de kleurstof zelf geen magnesium inhoudt: worden culturen op aardappelstukjes met alcohol a 96 V% uitgetrokken, wordt daarna de vloeistof gefiltreerd en uitgedampt, wordt eindelijk het uitgedampte opnieuw met aether uitgetrokken, dan bekomt men de roode kleurstof, die tot de noodige opzoekingen heeft gediend.

Omdat Bacillus prodigiosus niet zonder magnesium een roode kleur voortbrengt, heeft Nösske⁽⁴²⁾ daarin een zeer gevoelig proefmiddel op magnesiumverbindingen gevonden; met toenemende magnesiumhoeveelheden vermindert de vorming van kleurstof, zonder daarom de eigenlijke ontwikkeling tegen te werken.

(42) H. Nösske. Arch. klin. Chirurgie, 1900, 60, 266.

C. - Culturen op verschillende cultuurbodems.

Bacillus prodigiosus groeit zeer gemakkelijk op gewone voedende bodems, beter evenwel in aërobisch dan in anaërobisch leven. In dit laatste geval, is de ontwikkeling trager en wordt geen kleur voortgebracht⁽⁴³⁾.

Bouillon, met Bacillus prodigiosus ingezaaid, wordt na korten tijd troebel en bleekrood, vooral in de bovenste lagen; oude culturen worden slijmachtig. Worden de culturen van de voedende bodems afgezonderd, dan houden zij volgens Kappes⁽⁴⁴⁾, 85.45% water, en 13.47% asch in.

Op gelatine ontstaan na 24 uren en op 20°C, kleine ronde coloniën, met grijsachtige kleur, welke aan de oppervlakte van den bodem weldra een rood schijfje vormen, terwijl rond het schijfje de gelatine vloeibaar wordt; het vloeibaar worden gebeurt met groote snelheid, derwijze dat, na enkele uren, de gansche plaat met een roosachtig vocht bedekt is.

(43) G. Ritter. Zur Physiologie des Bacillus prodigiosus. Centr. Bakt., 2^e Abt., 1900, 6, 206.
M. Hefferan. Op. cit., 1904, Zie (6).

(44) H.C. Kappes. Analyse der Massenkulturen einiger Spaltpilzen und der Soorhefe. Diss. Leipzig, 1890.

[p. 338]

Wordt de bacterie, onder den vorm van een steek in het midden van de gelatine ingezaaid, dan wordt de bodem reeds na 12 uren rond de steek vloeibaar; de vloeistof is troebel en in de diepste lagen treft men een bloedrood vlekje aan. Na enkele dagen is de gansche gelatine vloeibaar geworden; de vloeistof is troebel, met een donkerrood neerslag op den bodem, en een bleekroode kleur, vooral aan de oppervlakte.

Beijerinck⁽⁴⁵⁾ bekwam door teelt drie stammen van Bacillus prodigiosus: de eene kon gelatine vloeibaar maken; de tweede maakte de gelatine niet vloeibaar en bracht de koolhydraten in gisting: de derde werkte ook niet vloeibaarmakend en kon daarenboven de koolhydraten niet in gisting brengen. Deze drie stammen vertoonden zich onveranderd in hunne eigenschappen.

Op agarbodem geeft de streepzaaiing breede slijmachtige lagen, welke mettertijd bloedrood worden en een metalischen weerschijn vertoonen. Na eenigen tijd ontstaat eene slijmachtige massa, welke alleen aan de bovenzijde in het rood is gekleurd, dus op de plaats die rechtstreeks met de lucht in aanraking is.

De ontwikkeling geschiedt op bijzonder gunstige wijze op aardappelstukjes; reeds na 24 uren komt een rijke cultuur te voorschijn, welke in het begin bleek is en later donkerrood wordt.

De caseïne van de melk wordt door Bacillus prodigiosus gestremd, zonder dat er evenwel een verdere ontbinding plaats grijpt. De vloeistof krijgt een roode kleur, vooral in de roomlagen die zich aan de bovenzijde vormen. Deze bacteriën schijnen een enzyme⁽⁴⁶⁾ af te zonderen, daar de stremming ook door gefiltreerde culturen wordt teweeggebracht.

(45) Beijerinck. Over de indigovorming uit de weede (Isatis tinctoria). Versl. Akad. Wetensch. Amsterdam, 1900, 91-99.

(46) C. Gorini. Studi sperimentali sull latte. Roma, 1892; Centr. Bakt., 1892, 12, 666.
C. Fermi. Centr. Bakt. 1891, 10, 13.
C. Gorini. Das Prodigiosus Labferment. Hyg. Rundschau, 1893, 3, 381.

[p. 339]

Daarentegen bevonden wij, dat de melkproteïnen van de melk na korten tijd gedeeltelijk worden geproteolyseerd. Dit blijkt namelijk uit de volgende cijfers:

Proteïnen in 100 kcm. melk.
Vóór het inzaaien	3.299 gr.
Na 6 dagen cultuur	2.086 gr.
Na 16 dagen cultuur	1.732 gr.

Na 6 dagen worden bijgevolg, meer dan 1 gr. proteïnen in peptone omgezet.

De culturen, in het bijzonder deze op aardappel, doen een groote hoeveelheid trimethylamine ontstaan, welke reeds door den reuk worden teruggevonden. De meeste schrijvers nemen aan, dat ook ammonia gevormd wordt, benevens indolsporen; zwavelwaterstof ontstaat er echter niet. In suikerhoudende bodems, zouden zich, naar zekere schrijvers, geringe sporen alcohol, alsook gassen voordoen⁽⁴⁷⁾, voornamelijk in anaërobische culturen. Ritter⁽⁴⁸⁾ trekt zulks evenwel in twijfel.

Volgens Schottelius⁽⁴⁹⁾ wordt suiker in alcohol en koolzuurgas ontbonden, wat Fraenkel⁽⁵⁰⁾ ook in zijn boek aanneemt. Naar verdere opsporingen van Scheurlen⁽⁵¹⁾, zou het ontstaan van het koolzuurgas het gevolg zijn van de werking van barnsteenzuur op natriumcarbonaat, twee verbindingen die zich gewoonlijk in cultuurbacillen bevinden of daarin worden voortgebracht.

In een omstandige mededeeling door haar gedaan, bespreekt Mary Hefferan⁽⁵²⁾ uitvoerig de biologie van Bacillus

(47) P. Liborius. Beiträge zur Kenntnis des Sauerstoffbedürfnisses der Bakterien. Zeitschr. Hyg., 1886, 1, 115.

(48) G. Ritter. Zur Physiologie des Bacillus prodigiosus. Centr. Bakt., 2^e Abt., 1900, 6, 206.

(49) M. Schottelius. Op. cit., 1887. Zie (17).

(50) C. Fraenkel. Grundriss der Bakterienkunde. Berlin, 1894.

(51) E. Scheurlen. Op. cit., 1896. Zie (7).

(52) Mary Hefferan. A comparative and experimental study of bacilli producing red pigment. Centr. Bakt., 2^e Abt., 1904, 11, 311-317, 397-404, 456-475, 520-540.

[p. 340]

prodigiosus. Deze geleerde heeft kunnen vaststellen, dat, zelfs bij volkomene afwezigheid van natriumcarbonaat, ook koolzuurgas ontwikkeld wordt; dit gas ontstaat wanneer de aanwezige suikersoort in de vloeistof, glucose, niet wanneer deze lactose of saccharose is. Bij aanwezigheid van asparagine werd ook, zelfs uit glucose, geen kolzuurgas afgescheiden.

Op mannose is de werking van Bacillus prodigiosus slechts gering. Dit feit werd vastgesteld door Sawamura⁽⁵³⁾, die proeven nam met bodems bereid uit mannoserijke wortels van Conophallus Konyaka, waaraan peptone, magnesiumsulfaat en kaliumphosphaat waren toegevoegd.

Uraea (pisstof) wordt slechts met geringe hoeveelheid ontbonden. Nitraten worden tot nitrieten gereduceerd⁽⁵⁴⁾. Volgens Stoklasa en Vitek⁽⁵⁵⁾ zou de reductie zelf tot ammonia leiden, doch alleenlijk in een bodem waar arabinose werd ingebracht; de omzetting zou tot 4,13% van de totale stikstofhoeveelheid bedragen.

Verder bevonden Stutzer en Rothe⁽⁵⁶⁾ dat, bij aanwezigheid van calciumcarbonaat in denzelfden tijd meer organische stikstof gevormd wordt uit ammoniastikstof dan uit salpeterstikstof.

De ontwikkeling van Bacillus prodigiosus in gistculturen⁽⁵⁷⁾, - namelijk in de Frohberg-gist, met welke een bijzondere proef-

(53) S. Sawamura. On the liquefaction of mannan by microbes. Bull. Coll. agric. Tokyo, 1903, 5, 259-262.

(54) Mary Hefferan. Op. cit., 1904. Zie (52).

(55) J. Stoklasa en E. Vitek. Beiträge zur Erkenntnis des Einflusses verschiedener Kohlenhydrate und organischer Säuren auf die Metamorphose des Nitrats durch Bakterien. Centr. Bakt., 2^e Abt., 1905, 14, 102.

(56) Stutzer en Rothe. Die Wirkung einiger Mikroorganismen des Bodens auf schwefelsaures Ammoniak und auf Salpeter. Fühlings landw. Zeit., 1904, 629.

(57) W. Henneberg. Untersuchungen an ruhenden Kulturhefen im feuchten und abgepressten Zustand. Ein Beitrag zur Kenntnis des Verhaltens, der Lebensdauer der Hefezellen, der Einwirkung fremder Organismen auf diese, sowie zur Kenntnis der spontanen Infektion, des Verderbens und der Fäulnis der Büchsenhefen. Wochenschr. Brauerei, 1904, n^o 41-48; Centr. Bakt., 2^e Abt., 1905, 14, 513.

[p. 341]

neming werd gedaan, - heeft ten gevolge die gisten zoodanig te schaden, dat zij na korten tijd sterven. Er ontstaat een sterk alkalinische reactie met sterke ammonia-ontwikkeling.

Bacillusprodigiosus is tot de indigogisting bekwaam⁽⁵⁸⁾.

Serum als cultuurbodem gebruikt wordt trapsgewijze vloeibaar gemaakt, en wordt rood.

(58) H. Molisch. Botanische Beobachtungen aus Java (I Abhandlung). Ueber die sogenannte Indigogährung und neue Indigopflanzen. Sitzungsber. Kais. Akad. Wiss. Wien, 1898, 107, I, 747-776.

D. - Nieuwe onderzoekingen.

Wij hebben verschillende onderzoekingen gedaan ten einde de physiologie van Bacillus prodigiosus nader te bestudeeren. In de volgende bladzijden laten wij het antwoord kennen op de negen vragen, welke wij ons, bij het aanvangen van onze onderzoekingen, gesteld hebben. Deze vragen luidden:

1^o	Welk verschil kan men in cultuurbodems met verschillende suikersoorten opsporen?
2^o	Welke is de werking van verschillende stikstofverbindingen, in dezelfde stikstofconcentratie benuttigd?
3^o	Op welke wijze ontstaat het zuur in stikstofhoudende culturen?
4^o	Welke is de invloed van zuur of alkali, wanneer zij worden toegevoegd aan melkcultuurbodems, waar Bacillus prodigiosus wordt ingezaaid.
5^o	Op welke wijze ontstaat het zuur in verschillende cultuurbodems, die stikstofverbindingen inhouden?
6^o	Ontstaat ammonia in normale melkculturen?
7^o	Welke is de invloed van de cultuurbodems op het ontstaan van het zuur?
8^o	Heeft de oorsprong van het zaad een invloed op de culturen?
9^o	Welk is de werking van Bacillus prodigiosus op de melksuiker en de caseïne van de melk?

[p. 342]

1^o Cultuurbodems met verschillende suikersoorten.

Om de oorspronkelijke reactie der cultuurbodems zooveel mogelijk onveranderd te behouden, kan men daaraan eene kleine hoeveelheid calciumcarbonaat toevoegen. Ontstaat er zuur, dan wordt dat zuur onmiddellijk geneutraliseerd; doch tegelijkertijd met deze neutralisatie, wordt koolzuurgas in vrijheid gesteld. De toevoeging van calciumcarbonaat schijnt eene werking uit te oefenen, namelijk op melk, zooals het door de volgende proef werd vastgesteld: in fleschjes met 50 kcm. melk en 0,5 gr. calciumcarbonaat, werd, na sterilisatie, Bacillus prodigiosus ingezaaid. Reeds na 24 uren vonden wij, bij eene temperatuur van 25°C, de roode culturen ontwikkeld, en enkele uren daarna was de vloeistof gestremd, zoowel bij aanwezigheid als bij afwezigheid van calciumcarbonaat.

Daar er geen ander middel bestaat, om de zuurvorming te bestrijden, waren wij verplicht in onze suikerhoudende vloeistoffen calciumcarbonaat te benuttigen, waar een der drie volgende soorten, druivensuiker (glucose), rietsuiker (saccharose) of melksuiker (lactose) werd ingebracht.

In de aldus bereide oplossingen, zelfs bij aanwezigheid van magnesiumsulfaat, konden bij gewone temperatuur, geen gekleurde culturen met rietsuiker en melksuiker bekomen worden; enkel met druivensuiker was de roode kleur ontstaan en nam de kleurintensiteit met de suikerconcentratie toe.

De volgende gesteriliseerde oplossingen waren voor de proeven bereid geworden: telkens 100 kcm. water met 5 gr., 4 gr., 3 gr., 2 gr., en 1 gr. der genoemde suikerssoorten, met 5 kcm. van eene oplossing magnesiumsulfaat a 1% en 0.1 gr. calciumcarbonaat.

Na 7 dagen werd uit de 15 cultuurfleschjes zaad gehaald en op gesteriliseerde aardappelstukjes ingezaaid: in al de onderzochte gevallen, werden reeds na twee dagen, schoone roode culturen bekomen.

Druivensuiker schijnt bijgevolg het best geschikt te zijn voor de normale ontwikkeling van Bacillus prodigiosus; in cultuurbodems waarin geen andere organische stoffen aanwezig zijn dan rietsuiker en melksuiker, is de ontwikkeling onvolledig.

[p. 343]

2^o Werking van verschillende stikstofverbindingen.

De invloed van de stikstof in verbonden toestand werd op de volgende wijze onderzocht. In fleschjes met 0,5 gr. zetmeel, 20 gr. water en 0.1 kem. van eene oplossing magnesiumsulfaat a 1%, werden hoeveelheden stikstofverbindingen ingebracht, overeenstemmende met 0.05 gr. stikstof, telkens onder de tien volgende vormen:

Ammoniumsulfaat	(NH4)2SO4:	0.236 gr.
Ammoniumnitraat	NH4NO3:	0.143 gr.
Ammoniumacetaat	NH4CO2CH3:	0.270 gr.
Kaliumnitraat	KNO3:	0.361 gr.
Uraea	CO(NH2'2:	0.107 gr.
Urinezuur	C3N4H4O3:	0.150 gr.
Hippurinezuur	C9NH9O3:	0.639 gr.
Asparagine	C4N2H10O3:	0.236 gr.
Asparaginezuur	C4NH7O4:	0.475 gr.
Caseïne:		0.322 gr.

Na sterilisatie dezer cultuurbodems op 115°C en na afkoeling, werd een wel ontwikkelde aardappelcultuur ingezaaid, die op 37° C werd behouden.

In het fleschje met asparagine was de ontwikkeling reeds na 24 uren zichtbaar; alleen na 11 dagen kon een lichtroode kleur in den caseïnebodem bemerkt worden. De andere bodems, ofwel gaven witte coloniën, ofwel lieten geen ontwikkeling bespeuren; met ammoniumsulfaat, ammoniumnitraat, kaliumnitraat, uraea, urinezuur, kon, door een nieuwe inzaaiing op aardappel, aangetoond worden dat de bacterie niet was uitgestorven en dat zij tot weinig ontwikkelde en niet gekleurde coloniën aanleiding had gegeven. Op de bodems met ammoniumacetaat, hippurinezuur en asparaginezuur waren geen coloniën ontstaan.

Uit al de onderzochte stikstofverbindingen, is dus gebleken dat asparagine de best geschikte voedingsverbinding is, en dat het niet onverschillig is de eene of de andere te gebruiken.

3^o Ontstaan van zuur in stikstofhoudende culturen.

Met het doel het ontstaan van zuur te bestudeeren, werd melk - een voor Bacillus prodigiosus zeer geschikte cultuur-

[p. 344]

bodem - genomen, waarin telkens 0.025 gr., 0,050 gr. en 0.075 gr. stikstof werden ingebracht, onder den vorm van ammoniumsulfaat, uraea, asparagine en caseïne. De gansche proef wordt in de volgende tabel samengevat:

melk kcm.	stikstof gr.	gebruikte stikstofverbinding		toestand der culturen na 7 dagen	kcm. noodige soda N/10 na 7 dagen
		soort	gr.
20	0.025	ammonium sulfaat	0.118	-	11.6
20	0.050	ammonium sulfaat	0.236	rood	11.5
20	0.075	ammonium sulfaat	0.354	rood	11.7
20	0.025	uraea	0.053	-	8.6
20	0.050	uraea	0.107	-	8.5
20	0.075	uraea	0.160	-	8.5
20	0.025	asparagine	0.118	-	9.7
20	0.050	asparagine	0.236	rood	10.4
20	0.075	asparagine	0.354	rood	11.5
20	0.025	caseïne	0.161	rood	9.2
20	0.050	caseïne	0.322	rood	9.1
20	0.075	caseïne	0.483	rood	9.3
20	-	geen	-	rood	8.5
20	-	geen	-	rood	8.4
20	-	geen	-	niet geënt (steriel)	8.5
20	-	geen	-	niet geënt (steriel)	8.5

[p. 345]

In deze proef vertoonde de gebruikte melk een reeds hoog zuurgehalte, zooals dit uit de cijfers van de niet ingezaaide bodems blijken mag. Indien wij nu het zuurgehalte, - in de proeven in kem. tiende-normaal sodaloog opgegeven, - in gevormd barnsteenzuur⁽⁵⁹⁾ uitdrukken, dan wordt deze hoeveelheid vastgesteld als volgt, na aftrekking der getallen voor het eerst voorkomend zuur van deze van het gevonden totaal:

(59) E. Scheurlen. (Op. cit., 1896, zie (7)) stelde de regelmatige aanwezigheid van barnsteenzuur in de culturen vast. Een kcm. N/10 barnsteenzuur houdt 0.0059 gr. zuur in.

Ammoniumsulfaat-houdende bodems:

Gr. stikstof.	Gr. barnsteenzuur.
0.025	0 01829
0.050	0.01770
0.075	0.01248

Uraea-houdende bodems:

Geen gevormd zuur.

Asparagine-houdende bodems:

Gr. stikstof.	Gr. barnsteenzuur.
0.025	0.00708
0.050	0.01121
0.075	0.01180

Caseïne-houdende bodems:

Gr. stikstof.	Gr. barnsteenzuur.
0 025	0.00513
0.050	0.00534
0.075	0.00572

In zuurrijke melk wordt dus, bij aanwezigheid van ammoniumsulfaat met asparagine, het meest zuur gevormd; met caseïne, ontstaat er een minder hoeveelheid zuur.

Deze proef werd opnieuw genomen en meer uitgebreid, edoch met minder zure melk en wel met 0.0125 gr., 0.0250 gr., 0.0500 gr., 0 0750 gr., 0.1000 en 0.1250 gr. stikstof. Daar asparagine door zich zelf een zwakzure functie vertoont, werd ook, zonder inzaaiing, een controleproef met deze stof genomen, ten einde het zuurgehalte door de ontwikkelde bacteriën voortgebracht, te kunnen bepalen.

[p. 346]

melk kcm.	stikstof gr.	gebruikte stikstofverbinding		toestand der culturen na 12 dagen	gebruikte kcm soda N/4 na 12 dagen
		soort	gr.
20	0.0125	ammoniumsulf.	0.059	gestremd	4.8
20	0.0250	ammoniumsulf.	0.118	rood, gestremd	5.3
20	0.0500	ammoniumsulf.	0.236	rood, gestremd	5.9
20	0.0750	ammoniumsulf.	0.354	rood, gestremd	5.8
20	0.1000	ammoniumsulf.	0.472	rood, gestremd	6.9
20	0.1250	ammoniumsulf.	0.590	rood, gestremd	6.5
20	0.0250	uraea	0.053	gestremd	5.9
20	0.0500	uraea	0.107	gestremd	5.8
20	0.0750	uraea	0.160	gestremd	5.4
20	0.0125	asparagine	0.059	rood, gestremd	6.4
20	0.0250	asparagine	0.118	rood, gestremd	6 0
20	0.0500	asparagine	0.236	rood, gestremd	7.2
20	0.0750	asparagine	0.354	rood, gestremd	7.6
20	0.1000	asparagine	0.472	rood, gestremd	7.8
20	0.1250	asparagine	0.590	rood, gestremd	7.8
20	0.0500	asparagine	0.236	nietgeënt, steriel	2.7
20	0.0750	asparagine	0.354	nietgeënt, steriel	2.9
20	0.0250	caseïne	0.161	rood, gestremd	5.9
20	0.0500	caseïne	0.322	rood, gestremd	6 2
20	0.0750	caseïne	0.483	rood, gestremd	4.7
20	0.1000	caseïne	0.644	rood, gestremd	4.5
20	0.1250	caseïne	0.805	rood, gestremd	6.0
20	-	geen	-	rood, gestremd	6.1
20	-	geen	-	rood, gestremd	5.8
20	-	geen	-	niet geënt	1.1
20	-	geen	-	niet geënt	1.0
20	-	geen	-	niet geënt	1.1

Op dezelfde wijze als in de voorgaande proef, kan men ook de uitslagen opgeven in door de bacteriën voortgebracht barnsteenzuur.

Hier werd de berekening gedaan, uitgaande van een vierde normaal oplossing, waarvan één kcm. met 0.01475 gr. barnsteenzuur overeenstemt.

[p. 347]

Ammoniumsulfaat-houdende bodems:

Gr. stikstof	Gr. barnsteenzuur
0.0125	0.0560
0.0250	0 0644
0 0500	0.0723
0.0750	0.0708
0.1000	0.0870
0.1250	0.0811

Uraea-houdende bodems:

Gr. stikstof	Gr. barnsteenzuur
0.0250	0.0723
0.0500	0.0708
0.0750	0.0649

Asparagine-houdende bodems:

Gr. stikstof	Gr. barnsteenzuur
0.0125	0.0581
0.0250	0.0472
0.0500	0.0649
0.0750	0.0708
0.1000	0.0737
0.1250	0.0737

Caseïne-houdende bodems:

Gr. stikstof	Gr. barnsteenzuur
0.0250	0.0723
0.0500	0.0767
0.0750	0.0543
0.1000	0.0516
0.1250	0.0737

Zuivere melkbodems:

Gr. barnsteenzuur

0.0752 en 0.0708; gemiddeld 0.0730

Over het algemeen kan gezeid worden, dat eene toevoeging van stikstofverbindingen aan de melk, de vorming van zuur, bij mindere concentratiën, niet bevordert. Met de veihooging van de concentratie bereikt het zuurgehalte dezelfde waarden als bij normale melk. Alleen met ammoniumsulfaat bereikt het zuurgehalte, bij gebruik van hoogere concentratiën, hoogere waarden dan deze van de zuivere melkculturen. Het verschil is echter slechts gering.

[p. 348]

Vergelijkt men de uitslagen van gezegde proef met deze van de proef met zure melk, dan bevindt men, dat het ontstaan van nieuw zuur door de werking van Bacillus prodigiosus, zeer sterk door het reeds aanwezig zuur wordt tegengewerkt.

4^o Culturen in melkbodems met toevoeging van alkali of zuur.

Volgens Kuntze⁽⁶⁰⁾ is het noodig de cultuurbodems voor Bacillus prodigiosus slechts zeer zwak alkalisch te maken, daar deze bacterie een ‘alkalibilder’ of alkalivormer is.

Het was dus van belang, in de eerste plaats dit feit opnieuw na te gaan, in de tweede plaats de werking van alkali en van zuur grondig te bestudeeren. In het onderzoek over alkali werd natriumhydroxyd benuttigd, terwijl wij voor dit over zuur de volgende organische zuren gebruikten, te weten melk-, appel-, wijnsteen- en citroenzuur, en wél in beide gevallen in toenemende hoeveelheid.

(60) W. Kuntze. Farbstoffbildung des Bacillus prodigiosus. Centr. Bakt., 1^e Abt., 44, 299-309.

Melk met natriumhydroxyd.

melk kcm.	oplossing natriumhydroxyd^(61) N/10	toestand der vloeistoffen na 12 dagen		gebruikte kcm. soda N/4 na 12 dagen
		geënt	niet geënt	geënt	niet geënt
20	0.1	rood, gestremd	niet gestremd	4.3	1.5
20	0.3	rood, gestremd	niet gestremd	4.9	1.3
20	0.5	rood, gestremd	niet gestremd	5.3	0.6
20	0.8	rood, gestremd	niet gestremd	5.5	1.4
20	1.0	rood, gestremd	niet gestremd	5.5	1.1
20	1.5	rood, gestremd	niet gestremd	5.9	1.0
20	2.0	rood, gestremd	niet gestremd	5.4	0.5
20	2.5	rood, gestremd	gestremd	4.7	0.6
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.2	1.2
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.4	1.2

(61) De oplossing N/10 natriumhydroxyd houdt in per liter 4 gr. natrimhycroxyd; reder kcm. komt dus overeen met 0.004 gr. opgeloste stof.

[p. 349]

Melk met melkzuur⁽⁶²⁾.

melk kcm.	oplossing melkzuur^(63) N/10	toestand der vloeistoffen na 12 dagen		gebruikte kcm. soda N/4 na 12 dagen
		geënt	niet geënt	geënt	niet geënt
20	0.1	rood	gestremd	6.7	1.6
20	0.3	rood	gestremd	5.9	1.3
20	0.5	rood	gestremd	4.7	1.7
20	0.8	rood	gestremd	4.9	1.7
20	1,0	rood	gestremd	5.2	1.6
20	1.5	rood	gestremd	5.7	1.7
20	2.0	rood	gestremd	4.6	1.8
20	2.5	rood	gestremd	4.9	2.0
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.2	1.2
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.4	1.2

(62) De melk was telkens, na de toevoeging van het melkzuur, reeds vóór de inzaaiing gestremd.

(63) De oplossing N/10 melkzuur houdt in per liter 9 gr, zuur; ieder kcm. komt overeen met 0.009 gr. zuur.

Melk met appelzuur⁽⁶⁴⁾.

melk kcm.	oplossing appelzuur^(65) N/10	toestand der vloeistoffen na 12 dagen		gebruikte kcm. sodaN/4 na 12 dagen
		geënt	niet geënt	geënt niet	geënt
20	0.1	rood, gestremd	gestremd	4.8	1.7
20	0.5	rood, gestremd	gestremd	5.7	1.7
20	1.0	rood, gestremd	gestremd	5.7	1.6
20	2.0	rood, gestremd	gestremd	5.8	2.3
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.2	1.2
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.4	1.2

(64) De melk was na de toevoeging van het zuur, vóór de inzaaiing gestremd, uitgezonderd bij de laagste concentratie.

(65) De oplossing appelzuur N/10, houdt in per liter 6.7 gr. zuur; ieder kcm. komt overeen met 0.0067 gr. zuur.

Melk met wijnsteenzuur

melk kcm.	oplossing wijnsteenzuur^(66) N/10	Toestand der vloeistoffen na 12 dagen		gebruikte kcm. soda N/4 na 12 dagen
		geënt	niet geënt	geënt	niet geënt
20	0.1	rood, gestremd	niet gestremd	5.2	1.5
20	0.5	rood, gestremd	niet gestremd	5.0	1.4
20	1.0	rood, gestremd	niet gestremd	5.6	1.6
20	2.0	rood, gestremd	gestremd	5.2	2.0
20	-	rood, gestremd	gestremd	5.2	1.2
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.4	1.2

(66) De oplossing N/10 wijnsteenzuur houdt in per liter 7.5 gr. zuur; ieder kcm. komt dus overeen met 0.0075 gr. zuur.

[p. 350]

Melk met citroenzuur

melk kcm.	oplossing citroenzuur^(67) N/10	toestand der vloeistoffen na 12 dagen		gebruikte kcm. soda N/4 na 12 dagen
		ingezaaid	niet ingezaaid	ingezaaid	niet ingezaaid
20	0.1	rood, gestremd	niet gestremd	5.1	1 1
20	0 5	rood, gestremd	niet gestremd	5.6	1.7
20	1.0	rood, gestremd	gestremd	5.3	2.1
20	2.0	rood, gestremd	gestremd	5.1	1.8
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.2	1.2
20	-	rood, gestremd	niet gestremd	5.4	1.2

Het gevormde zuur, in barnsteenzuur⁽⁶⁸⁾ uitgesproken, is in de onderzochte gevallen na 12 dagen als volgt:

concentratie der gebruikte stoffen	natriumhydroxyd	melkzuur	appelzuur	wijnsteenzuur	citroenzuur
0.1	0.0413	0.0752	0.0457	0.0546	0.0590
0.3	0.0531	0.0678	-	-	-
0.5	0.0693	0.0442	0.0590	0.0531	0 0575
0.8	0.0605	0.0472	-	-	-
1.0	0.0649	0.0531	0.0752	0.0590	0 0472
1.5	0.0723	0.0590	-	-	-
2.0	0.0723	0.0413	0.0516	0.0442	0.0487
2.5	0.0620	0.0428	-	-	-
0	0.0605	0.0605	0.0605	0,0605	0.0605

De aanwezigheid van wijnsteen- en citroenzuur werkt dus de zuurvorming in de culturen tegen; melkzuur en appelzuur schijnen een optimum van concentratie te vertoonen, waarop het zuur een hoogere waarde dan in de normale voorwaarden bereikt. De toevoeging van alkali werkt gunstig te beginnen met een bepaalde concentratie, ongunstig bij een groote verdunning. Dit stemt niet overeen met de bewering van W. Kuntze,⁽⁶⁹⁾ dat Bacillus prodigiosus een alkalivormer zou

(67) De oplossing N/10 citroenzuur houdt in per liter 6.4 gr. zuur; ieder kcm. komt overeen met 0.0064 gr. zuur.

(68) Hier dient herinnerd te worden dat één kcm. vierde normale oplossing met 0.01475 gr. barnsteenzuur overeenstemt.

(69) W. Kuntze. Op. cit. Zie (60).

[p. 351]

zijn; men weet immers dat de afscheidingsproducten der levende wezens gewoonlijk een schadelijken invloed op de levensverrichtingen dezer wezens uitoefenen.

Men zou echter kunnen beweren, dat de gevormde alkali geen natriumhydroxyd is, en wel liever ammonia, welke zich met het zuur verbindt en tot ammoniazouten aanleiding geeft. Daarom hebben wij het gehalte van het gebonden ammonia in de culturen bepaald (zie 6^o). Doch eerst werd het zuur stelselmatig gedoseerd in de zuivere melkculturen, en wel na 1 tot 57 dagen.

5^o Vorming van zuur in melkculturen.

De vorming van het zuur werd nagegaan voor verschillende perioden gaande van 1 tot 57 dagen na de inzaaiing.

melk kcm.	gebruikte kcm. soda N/4
	na dagen	met inzaaiing	zonder inzaaiing
20	1	4.5	-
20	2	6.5	1.5
20	6	7.6	1.7
20	9	7.9	1.5
20	13	7.9	-
20	20	8.7	-
20	27	8.5	-
20	57	8.2 - 8.2	-

Het gevormde zuur, in barnsteenzuur uitgerekend, kan door de volgende cijfers voorgesteld worden; de culturen zonder inzaaiing bieden een zuurheidsgraad aan van 1.5, 1.7, 1.5 kcm.; dus gemiddeld 1.6 kcm. N/4.

na dagen	kcm. N/4	gr. barnsteenzuur
1	4 5 - 1.6 = 3.9	0.0575
2	6 5 - 1.6 = 4.9	0.0723
6	7 6 - 1.6 = 6 0	0.0885
9	7.9 - 1.6 = 6.3	0.0939
13	7.9 - 1 6 = 6.3	0.1939
20	8.7 - 1.6 = 7.1	0.1047
27	8 5 - 1.6 = 6 9	0.0018
57	8.2 - 1.6 = 6.6	0.0973

[p. 352]

Uit deze proef wordt afgeleid, in de eerste plaats dat Bacillus prodigiosus feitelijk een zuur-, niet een alkalivormer is; - in de tweede plaats, dat het zuurgehalte na ongeveer 20-27 dagen een maximum bereikt, waarop zich daarna vermindering laat waarnemen.

6^o Opzoeken van gebonden ammonia in de culturen

Er blijft nu, benevens het vaststellen van het vormen van zuur, op te zoeken of er in de culturen ammonia ontstaat, dat zich daarna met het ontstane zuur verbindt.

Het opzoeken en het doseeren van ammonia uit de ammoniumzouten in de culturen ontstaan, werden op 20 kcm. melk beproefd, waar Bacillus prodigiosus werd ingezaaid. De cultuur werd met 50 kcm. natriumhydroxyd a 25% gedistilleerd, en de ammoniadampen in 50 kcm. N/10 zuur opgevangen, zooals in de doseeringsmethode van Kjeldahl. Op deze wijze werden de volgende waarden verkregen, telkens met 20 kcm. melk:

dagen na de inzaaing	zuurheidsgraad der culturen uitgedrukt in kcm soda N/4	kcm. S/10 soda tot het neutraliseeren	kcm. N/10^(70) ammonia	gewicht ammonia
13	7.9	41.4	50.0 - 41.4 = 8.6	0.01462 gr.
14	-	37.4	50.0 - 37.4 = 12.6	0.02242 gr.
57	8.2	34.0	50.0 - 34.0 = 16.0	0 02720 gr.
		34.7	50.0 - 34.0 = 15.4	0.02567 gr.

Of er hier van een wel merkbare toeneming van ammonia kan gesproken worden, om Bacillus prodigiosus als een voortbrenger van alkali te noemen, mag wel in twijfel getrokken worden. Het ontstaan van ammonia in de culturen is hier niet buitengewoon; het ammoniagehalte valt binnen de grenzen van de waarden bij andere gewone bacteriën aangetroffen.

(70) 1 kcm. N/10 ammoniaoplossing houdt in 0.0017 gr. ammonia.

[p. 353]

7^o Invloed van de cultuurbodems op het ontstaan van het zuur.

Om de vraag op te lossen, welke de invloed is van de cultuurbodems op het ontstaan van het zuur, werden vergelijkende proeven genomen met melk, met aardappelbrei en met zetmeelstijfsel. De melk was gewone centrifugemelk; - de aardappelbrei was bereid uit fijn doorgestoken gekookte aardappelen, welke in eene hoeveelheid van 10% met gedistilleerd water waren gemengd en dooreengeschud; - het zetmeelstijfsel was uit 2% zuiver aardappelzetmeel en kokend water vervaardigd.

Telkens werden 20 kcm. der cultuurbodems in proefbuisjes gebracht, zonder of met alkah (N/10 oplossing natriumhydroxyd), of met zuur (N/10 oplossing wijnsteenzuur); door toevoeging van gedistilleerd water werden de volumina constant gehouden, en wel op 23 kcm. Na sterilisatie op 120° C en na afkoeling, werd Bacillus prodigiosus ingezaaid.

Eerste cultuurbodem: melk.

samenstelling der cultuurbodems				toestand der culturen na 3 dagen	kcm. N/4 natriumhydroxyd na dagen
kcm. melk	kcm. gedist. water	kcm. N/10 natriumhydroxyd	kcm. N/10 wijnsteenzuur		0	5	18
20	-	-	-	niet ingezaaid	-	1.5	-
20	3	-	-	niet gestremd	1.5	5.4	6.5
20	2	1	-	niet gestremd	1.1	6.7	7.7
20	1	2	-	niet gestremd	0.8	7.0	7.9
20	-	3	-	niet gestremd	0.6	7.0	8.3
20	2	-	1	niet gestremd	1.9	6.1	6.7
20	1	-	2	niet gestremd	2.1	6.6	6.7
20	-	-	3	niet gestremd	2.6	6.5	7.2

Deze uitslagen, berekend zooals boven, worden in door de coloniën gevormd barnsteenzuur:

	na 5 dagen	na 18 dagen
zonder toegevoegde stoffen:	0.0575 gr.	0.0737 gr.
met 1 kcm. natriumhydroxyd:	0.0826	0.0973
met 2 kcm. natriumhydroxyd:	0.0914	0.1047
met 3 kcm. natriumhydroxyd:	0.0944	0.1136
met 1 kcm. wijnsteenzuur:	0.0619	0.0708
met 2 kcm. wijnsteenzuur:	0.0664	0.0678
met 3 kcm. wijnsteenzuur:	0.0575	0 0678

[p. 354]

Hieruit kunnen derhalve de gunstige invloed van het alkali en de schadelijke invloed van het zuur opgemaakt worden.

Tweede cultuurbodem: aardappelbrei.

samenstelling der cultuurbodems				toestand der culturen na dagen		kcm N/4 natriumhydroxyd na dagen
kcm. bret	kcm. gedist. water	kcm. N/10 natriumhydroxyd	kcm. N/10 wijnsteenzuur	5	18	0	5	18
20	-	-	-	niet ingezaaid		-	0.7	-
20	3	-	-	rood	rood	0.9	0.9	0.2
20	2	1	-	rood	rood	0.5	0 6	0.2
20	1	2	-	bleekrood	rood	0.3	0.7	0.4
20	-	3	-	niet gekleurd	niet gekleurd	0.1	0.5	0.3
20	2	-	1	rood	rood	1.0	1.0	0.2
20	1	-	2	rood	rood	1.5	1.4	0.1
20	-	-	3	bleekrood	rood	1.8	1.5	0.4

Deze uitslagen, in barnsteenzuur berekend, worden:

	na 5 dagen	na 18 dagen
zonder toegevoegde stoffen:	0	vermindering
met 1 kcm. natriumhydroxyd:	0.00147 gr.	vermindering
met 2 kcm. natriumhydroxyd:	0.00590	0.00147 gr.
met 3 kcm. natriumhydroxyd:	0.00590	0.00202
met 1 kcm. wijnsteenzuur:	0	vermindering
met 2 kcm. wijnsteenzuur:	vermindering	vermindering
met 3 kcm. wijnsteenzuur:	vermindering	vermindering

Bij de proef met aardappelbrei vinden wij dus, ofwel een zeer zwakke verhooging van het zuur, ofwel een kleine vermindering, wat met het ontstaan van alkali overeenstemt.

[p. 355]

Derde cultuurbodem: zetmeelstijfsel.

samenstelling der cultuurbodems				toestand der culturen na 18 dagen	kcm n/4 neutraliseerende oplossing na dagen
kcm. stijfsel	kcm. gedist water	kcm. N/10 natriumhydroxyd	kcm. N/10 wijnsteenzuur		N/4 natrimhydroxyd			N/4 zuur
					0	5	18	0	5	18
20	-	-	-	niet ingezaaid	-	0	-	-	0	-
20	3	-	-	niet gekleurd	-	0	-	-	0	-
20	2	1	-	niet gekleurd	-	-	-	0.1	0.1	0.1
20	1	2	-	niet gekleurd	-	-	-	0.1	0.1	0.1
20	-	3	-	niet gekleurd	-	-	-	0.4	0.1	0.1
20	2	-	1	niet gekleurd	0.5	0.4	0.4	-	-	-
20	1	-	2	niet gekleurd	0.9	0.8	0.7	-	-	-
20	-	-	3	bleekrood	1.3	1.2	1.1	-	-	-

De uitslagen, in barr steenzuur uitgerekend, worden:

	na 5 dagen	na 18 dagen
zonder toegevoegde stoffen:	0	0
met 1 kcm. natriumhydroxyd:	0	0
met 2 kcm. natriumhydroxyd:	0	0
met 3 kcm. natriumhydroxyd:	0.00442 gr.	0 00442 gr.
met 1 kcm. wijnsteenzuur:	vermindering	vermindering
met 2 kcm. wijnsteenzuur:	vermindering	vermindering
met 3 kcm. wijnsteenzuur:	vermindering	vermindering

Wat wij over den tweeden cultuurbodem zegden, is bijgevolg hier ook toepasselijk. De beweringen van Kuntze⁽⁷¹⁾, aangaande de vorming van alkali, worden hierdoor werkelijk bekrachtigd, doch het ontstaan van het alkali is zeer weinig merkbaar.

Uit de vergelijking der in de drie reeksen bekomen uitslagen, blijkt zeer duidelijk welken grooten invloed de cultuurbodem uitoefent, en hoe de werking der levensvoorwaarden op de wezens, in de studie der bacteriën gemakkelijk kan nagegaan worden.

(71) Kuntze. Op. cit. Zie (60).

[p. 356]

8^o Invloed van den oorsprong van het zaad.

Culturen van Bacillus prodigiosus, op verschillende bodems gekweekt en van verschillenden ouderdom, werden in steriele melk ingezaaid, en na 1, 6 en 20 dagen werd het zuurgehalte gedoseerd. Overal waren reeds na éen dag roode coloniën ontstaan.

oorsprong van het zaad	ouderdom van het zaad in dagen	toestand der culturen na 1 dag	kcm. N/4 natriumhydroxyd tot het neutraliseeren van 20 kcm. cultuurmelk, na dagen
			0	1	6	20
Aardappelstukjes	60	rood	1.2	2.8	6.6	8.1 - 8.0
Aardappelstukjes	34	rood	1.2	2.8	6.6	8.9 - 9.3
Aardappelstukjes	4	rood	1.2	3.1	7.1	9.9 - 9.0
Aardappelbrei	4	rood	1.2	2 9	7.2	9.5 - 9.8
Melk	4	rood	1.2	2.9	7.1	9.1 - 8.8
Zetmeelstijfsel	4	rood	1.2	2.4	6.8	8.7 - 8.7

Daaruit volgt, dat het verschil tusschen de onderzochte zaadsoorten niet zeer groot is: het zaad uit zetmeelstijfsel is het zwakste; jonge culturen op aardappelstukjes of op aardappelbrei brengen de aan zuur rijkste coloniën voort.

9^o Werking van de bacteriën op de melk.

De meeste onzer proefnemingen zijn gedaan geweest met melk; benevens de vaststelling van het ontstaan van het zuur, is het stellig ook van belang te bepalen welke omzettingen de melksuiker en de proteïnen⁽⁷²⁾ ondergaan.

(72) Over de doseering van melksuiker en proteïnen in de melk, zie: A.J.J. Vandevelde, Over melk en melkvervalsching, Uitgave van de Koninklijke Vlaamsche Academie. Gent, 1907, blz. 72 en 75.

Melksuiker in 100 kcm.

Vóór het inzaaien: 4.439 gr. - Culturen van 6 dagen: 2.031 gr. - Culturen van 16 dagen: 1.269 gr.

De omzetting van de melksuiker bedraagt bijgevolg 54% na 6 dagen, en 73% na 16 dagen.

[p. 357]

Proteïnen in 100 kcm.

Vóór het inzaaien: 3.299 gr. - Culturen van 6 dagen: 2.086 gr. - Culturen van 16 dagen: 1.732 gr.

De omzetting van de proteïnen bedraagt 36%, na 6 dagen, en 50% na 16 dagen.

E. - Werking op levende wezens.

Alhoewel Bacillus prodigiosus niet onder de ziektebacteriën dient gerekend te worden, schijnt het niettemin dat Marx en anderen⁽⁷³⁾ er zouden in gelukt zijn, bij middel van onderhuidsche inspuitingen, kikvorschen en muizen te dooden. In de culturen werd een toxalbumine teruggevonden, doch de toxische hoeveelheid, tot het dooden van dieren noodig, is zeer groot. Inspuitingen dezer toxische oplossingen, beneden de toxische waarde, verhoogen de gevoeligheid der dieren voor andere besmettingsoorzaken; zelfs worden daardoor zekere dieren⁽⁷⁴⁾ voor bepaalde ziekten vatbaar, waartegen zij in den gewonen toestand, weerstand bieden.

(73) H. Marx. Bakteriologische Mitteilungen. Pathogenität der Bacillus prodigiosus. Arch. Klin. Chir., 1900, 62, 347. - E. Bertarelli. Untersuchungen und Beobachtungen über die Biologie und Pathogenität des Bacillus prodigiosus. Centr. Bakt., 1903, 34, 193. - A. Wernich Versuche über die Infektion mit Micrococcus prodigiosus. Cohns Beitiäge Biol. Pflanzen, 3, 105.

(74) Roger. Sur l'inoculation du charbon symptomatique du lapin. Sec. biol. Paris, 1889.

F. - Schadelijke werkingen.

Kurzwelly⁽⁷⁵⁾ vond dat Bacillus prodigiosus, op vaste cultuurbodems gekweekt, door alcohol, aether, benzol en zwavelkoolstof gedood wordt; na uitdroging in een exsiccator, was deze bacterie nog levend na een verblijf van 14 dagen in alcohol, aether of benzol, en van 63 dagen in zwavelkoolstof. De aanwezigheid van vochtigheid verhoogt dus de giftigheidskracht der onderzochte giften.

Door teelt in voedende gelatine bij aanwezigheid van 2% phenol, bekomt men kleurlooze coloniën. Zaait men van deze

(75) W. Kurzwelly. Ueber die Widerstandsfähigkeit trockener pflanzlicher Organismen gegen giftige Stoffe. Jahrb. wiss. Bot., 1905, 38, 291.

[p. 358]

culturen uit, dan bekomt men tot de negende generatie kleurlooze cellen⁽⁷⁶⁾.

Over de ongunstige werking van kaliumnitraat hebben Loew en Kozai⁽⁷⁷⁾ eene mededeeling laten verschijnen.

Culturen in water of in voedende gelatine worden gedood, wanneer op den inhoud van een fleschje van 250 kcm. een electrische stroom van 2,5 ampères en 1,25 volts gedurende 24 uren inwerkt⁽⁷⁸⁾.

Zeer zorgvuldige proeven, waaruit alle mogelijke werkingen van elektrolyten en warmte totaal waren gesloten, hebben bewezen, dat de electrische stroom, zelfs na 62 uren, zich gansch onschadelijk vertoont⁽⁷⁹⁾.

De werking van het electrisch licht werd door S. Bang⁽⁸⁰⁾ onderzocht: de culturen werden in hangende druppels tusschen parallele kwartsplaatjes gebracht; om de temperatuur constant te houden, werd de onderste kwartsplaat met verwarmd water gespoeld, en de warmtestralen van de booglamp werden door eene laag water van 0.025 m. dikte tusschen kwartsplaten tegengehouden. In deze voorwaarden en bij eene constante temperatuur van 30°C, werden de culturen op een afstand van 0.28 m., aan de werking van een electrischen lichtboog van 35 ampères en 50 volts, onderworpen. De bacteriën werden na eene werking van 1 tot 5 minuten gedood. Bij een hoogere temperatuur dan 30°C, b.v. bij 45°C, werd die tijd tot op slechts 30 seconden verminderd.

Radiumstralen werken vertragend, - doch veroorzaken den dood niet⁽⁸¹⁾.

Hevige schuddingen oefenen op de ontwikkeling van Bacillus prodigiosus geen invloed uit⁽⁸²⁾.

(76) G. Galeotti Lo sperimentale, 1892, Bd. 47.

(77) Loew en Kozai. Bull. Coll. Agric. Tokyo, 1903, 5, 2.

(78) W. Spilker en A. Gottstein. Centr. Bakt., 1891, 9, 77.

(79) Friedenthal. Centr. Bakt., 1^e Abt., 1896, 20, 505. - C. Wolf. Centr. Bakt., 1^e Abt., 1899, 25, 650.

(80) S. Bang Mitteil. aus Finsens Mediz. Lichtinst. Kopenhagen, 1903, 2, 1.

(81) Aschkinass en Caspari. Pflügers Archiv. 1901, 86, 603.

(82) B. Schimdt. Arch. Hyg. 1891, 13, 247.