1588-98 (1857-58; nieuwe uitgave, Amsterdam 1861; 3e dr. 's Gravenhage 1882; 4e dr. 's Gravenhage 1889; 5e dr. 's Gravenhage 1897; 6e dr. 's Gravenhage 1904).
Dit boek gaf iets geheel nieuws, de beschrijving van de ontwikkeling van land en volk in een gewichtige periode van overgang, bezien van verschillende zijden. Uit de bronnen zelf puttende, gaf Fruin een uitbeelding van een zeer belangrijke, vroeger weinig behandelde periode: niet alleen de politieke geschiedenis werd hier ontvouwd, maar ook de economische historie en ook de geschiedenis van het geestelijk leven van ons volk; dat alles wordt samengevoegd tot een eenheid, die waarlijk het beeld geeft van land en volk op het einde der zestiende eeuw. En als om te bewijzen, dat hij ook in andere perioden der vaderlandsche geschiedenis volkomen thuis was, gaf Fruin in 1858 zijn eerste Gidsartikel, de fijne psychologische studie Hugo de Groot en Maria van Reigersbergh, kort daarna gevolgd door het magistrale werk Het voorspel van den tachtigjarigen oorlog, dat de hoofdlijnen van dit tijdvak voor goed vastlegde. Naast Bakhuizen van den Brink was hij de wetenschappelijke historicus van Nederland geworden en gebleken. Toen dan ook Matthijs de Vries, die in 1853 van Groningen naar Leiden als hoogleeraar was teruggekeerd, de vaderlandsche geschiedenis wenschte prijs te geven, kwamen eigenlijk alleen Bakhuizen van den Brink en Fruin in aanmerking. Met instemming en zelfs medewerking van Bakhuizen zelf werd Fruin in Februari 1860 benoemd tot hoogleeraar in de vaderlandsche geschiedenis te Leiden.
Hij aanvaardde zijn ambt den 1en Juni 1860 met het uitspreken van een rede: De onpartijdigheid van den geschiedschrijver (Amsterdam 1860). Tot den wettelijken termijn heeft Fruin zijn ambt bekleed. Gedurende den cursus 1877-78 was hij rector magnificus; 8 Februari 1878 sprak bij als zoodanig Over de plaats, die de geschiedenis in den kring der wetenschappen inneemt (Jaarboek der Rijks-Universiteit te Leiden, 1877-78, 47 vlg). In 1894 nam hij zijn ontslag uit zijn ambt; den 1en Juni 1894 trad hij af als hoogleeraar met een Afscheidsrede ('s Gravenhage 1894). Tot zijn dood is Fruin in Leiden blijven wonen. Hij bleef ongehuwd.
De drie genoemde oraties, waarin Fruin zijn denkbeelden over zijn wetenschap en het wetenschappelijk onderzoek heeft ontwikkeld, geven zijn ontwikkelingsgang duidelijk weer. In 1860 had hij een duidelijke voorstelling van de subjectiviteit, die den geschiedschrijver eigen is; hij kan de dingen nu eenmaal niet anders zien dan zij zich aan zijn geestelijk bewustzijn vertoonen; de overeenkomst, maar tevens het onderscheid tusschen den scheppenden kunstenaar en den historicus worden uiteengezet; de geschiedkundige wordt vergeleken met een schilder, die het verleden uitbeeldt, zooals hij het ziet, maar naar het beeld, dat zich bij hem na zorgvuldig bronnenonderzoek heeft gevormd. Hierin ligt dus een zeer subjectief element; van strakke objectiviteit is geen sprake. In 1878 is hij van dat standpunt afgeweken; hij is dan onder den indruk gekomen van de methoden en resultaten der natuurwetenschappen en meent, dat de historische wetenschap daarvan nut kan trekken. Zelfs acht hij op den duur het vinden van historische wetten mogelijk en zelfs waarschijnlijk. Hij spreekt dan van een hoogere objectiviteit, die den geschiedschrijver in den waren zin des woords eigen moet zijn; door oefening en ervaring kan de onderzoeker zich die objectiviteit eigen maken, die hem plaatst